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超声波提取龙胆多糖工艺

信息来源:/ 编辑:澳门正规网赌网站 发布时间:2017-01-19 11:30

       龙胆为龙胆科植物条叶龙胆Gentiana manshurica Kitag.、龙胆G.scabra Bunge、三花龙胆G.triflora Pall.或坚龙胆G.rigescens Franch. 的干操根及根茎,具有清热燥湿、泻肝胆火的功效,主治湿热黄疽、阴肿阴痒、带下、强中、湿疹搔痒、目赤等症。龙胆除含有裂环环烯醚萜类和环烯萜类化合物外,还含有生物碱、挥发油、多糖等成分。目前多糖提取文要采用传统水浸提取法,该方法存在费时长、耗能多的缺点。有文献报道将超声波应用于对中药苷类成分的提取中可以提高苷类的提出率并缩短提取时间。初步药理实验表明,龙胆多糖有一定的免疫增强作用。本研究考察超声波在龙胆多糖的提取中应用的可行性,对实验条件进行优化,并和传统水提法进行比较。


1 仪器与试药


  UV-2102C型紫外可见分光光度计,尤尼柯(上海)仪器有限企业;JP600G型超声波提取罐,澳门正规网赌网站。试剂均为AR级。龙胆药材购自哈尔滨三棵树药材市场,经我院中药鉴定室沈志滨副教授鉴定为条叶龙胆。


2 方法与结果


2.1 超声波提取龙胆多糖:称取一定质量龙胆粉末,加入蒸馏水适量,分别用一定频率的超声波超声处理,提取液滤过、浓缩、去蛋白、乙醇沉淀,得粗品多糖,真空干燥,即得。


2.2 龙胆多糖的测定


2.2.1 葡萄糖对照品溶液的制备:精密称取105℃ 干燥至恒重的葡萄糖100mg,置于100mL量瓶中,加入蒸馏水至刻度,摇匀,备用。


2.2.2 龙胆多糖供试品液的制备:精密称取干燥至恒重的龙胆多糖23.80mg,置于100mL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀即得。


2.2.3 苯酚溶液的制备:取苯酚100g,加铝片0.1 g与碳酸氢钠0.05g,蒸馏收集18℃馏分,称取此馏分10g,加水150g,置于棕色瓶中备用。


2.2.4 标准曲线的绘制:精密汲取葡萄糖对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL置于50mL量瓶中,加入蒸馏水至刻度,摇匀。精密汲取各溶液2mL于 10mL具塞刻度试管中,分别加入5%苯酚溶液1 mL,摇匀。迅速加入5mL浓硫酸,振摇5min,定容,置沸水浴中加热15min,然后置冷水浴中冷却 30min,定容,随行空白,在490nm处测定吸光度。数据经回归处理后,得回归方程:A=12.886 C+0.001 5,r=0.999 7。


2.2.5 换算因子的测定:精密量取多糖供试品溶液 0.5mL,按照“标准曲线的绘制”项下的方法测定吸光度值,计算葡萄糖的质量浓度,得换算因子f= 5.418 5。


2.2.6 多糖的测定:精密称取各样品溶液1mL,分别置于10mL具塞刻度试管中,按照“标准曲线的绘制”项下方法测定吸光度值,按下式计算样品中多糖的质量分数。


C·D·f

多糖=——————×100%

W

  式中C为样品溶液的葡萄糖的质量,D为样品溶液的稀释倍数,f为换算因子,W为样品的质量 

2.3 超声波法提取多搪的单因素考察


2.3.1 超声时间对多糖提取的影响:称取相同质量龙胆粉末5份,加入蒸馏水适量后分别用一定频率的超声波超声处理15、30、45、60、75、90、120min, 后处理同2.1。结果见图1。可知,超声提取75min 时提出量最高,多糖提出率可达14.4%。而后随着超声时间的延长,龙胆多糖的提取率无多大变化,并有缓慢下降之趋势。


图1 提取时间对多糖得率的影晌

Fig.1 Effect of extracting time on polyssacharide yield


2.3.2 pH值对多搪提取的影响:称取相同质量龙胆粉5份,分别加入蒸馏水适量,然后分别调节pH 为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,超声处理75min,后处理同2.1。结果见图2,可知,超声提取pH值为7时提取率最高,粗多糖提出率可达14.2%。


图2 pH 值对多糖得率的影晌

Fig.2 Effect of pH value on polyssacharide yield


2.3.3 加入蒸馏水量对多糖提取的影响:称取相同质量龙胆粉5份,分别按药材量与蒸馏水质量体积比为1:20、1:40、1:60、1:80、1:100加入蒸馏水,超声处理75min,后处理同2.1。结果见图3。可知,超声提取加入蒸馏水量为龙胆粉:蒸馏水(1: 60)时提取率最高,粗多糖提出率可达14.1%。


2.4 提取条件的优化:在单因素考察的基础上,称取相同质量的龙胆粉9份,分置于9个烧杯中,选用 L9<34)正交表进行优化,结果见表1。正交实验结果表明在龙胆粉末中加入60体积的水,在pH 7.0的条件下用超声波提取75min得到的龙胆多糖的量最大。根据极差分析结果,影响龙胆多糖提出率的3个因素中(pH、提取时间、加水量)以提取时间影响最大,其次是加水量,影响最小的是pH。


图3 水体积对多精收率的影响

Fig.3 Effect of water volume on polyssacharide yield


表1 L9(34)正交优选设计及结果

Table 1 L9(34)orthogonal design and result

s

——————————————————————————

A超声时 B pH值 C加入蒸馏 D 多糖

试验号 间/min 水量/倍 (空白) /%

——————————————————————————

1 1(60) 1(6.0) 1(40) 1 1452

2 1 2(7.0) 2(60) 2 1737

3 1 3(8.0) 3(80) 3 1581

4 2(75) 1 2 3 1560

5 2 2 3 1 1481

6 2 3 1 2 1392

7 3(90) 1 3 2 1492

8 3 2 1 3 1429

9 3 3 2 1 1385

K1 0.4770 0.4504 0.4273

K2 0.4433 0.4647 0.4682

K3 0.4306 0.4358 0.4554

k1 0.1590 0.1501 0.1424

k2 0.1478 0.1549 0.1561

k3 0.1435 0.1453 0.1518

R 0.0155 0.0096 0.0137

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2.5 传统方法提取与精制龙胆多糖:将干燥粉碎后的龙胆生药样品称取100g,用500mL石油醚回流脱脂2次,每次1h。回收石油醚,药渣挥干溶剂后用 80%乙醇500mL浸渍过夜,回流提取2次,每次 2h。滤过,将药渣用2500mL蒸馏水90℃温浸提取60min,再用500mL蒸馏水90℃重复温浸提取 60min,滤过,合并滤液。将此溶液减压浓缩至200 mL用氯仿萃取多次以除去蛋白质,再加1%活性炭脱色2次,滤过,滤液加入95%乙醇使乙醇的体积分数达到80%,静置过夜,残渣依次用95%乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚多次洗涤,真空干燥,得精制龙胆多糖。与超声提取的结果比较,见表2。


3 讨论


3.1 超声波法提取龙胆多糖时,超声时间不宜过


表2 两种提取方法结果比较(n=5)

Table 2 Comparison of two extracting methods(n=5)

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方法  粗多糖/g 提取率/% 多糖/%

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水提 0.152±0.021 15.20±2.10 19.80±1.57

超声 0.168±0.022 16.80±2.20* 28.19±1.52**

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与水提相比较:*P>0.05 **P<0.05


*P>0.05 **P<0.05 vs water extracting 长。超声处理75min时提取率达到最大,随着处理时间的延长,提取率反而下降。原因可能是由于超声波具有较强的剪切作用,长时间的作用会使大分子的多糖断裂,从而在后处理的过程中的损失增大而影响多糖的提出率。


3.2 龙胆多糖的组成十分复杂,由多种单糖组成。目前最常用的测定方法是蒽酮-硫酸比色法和苯酚- 硫酸比色法。但在实际工作中,特别是在测定天然产物中的糖测定时,测得的结果与实际情况不符。原因是这两种方法都是以葡萄糖作为对照,这对含有多种单糖的天然多糖来说必将使测量值与实际值不符。本实验中有将近70%的产物未被检出,这是在多糖测定方法的研究中经常遇到的问题。如果在制作标准曲线时能够根据多糖的组成,用多种单糖适当混合后作为对照,就可以在一定程度上改善这种情况。


3.3 植物多糖作为免疫增强剂已引起人们的广泛关注,临床用于肿瘤病人的治疗已取得较好疗效。龙胆多糖可否作为免疫增强药物应进一步深入研究。 (中草药第36卷第6期 江蔚新,朱正兰)


  产品型号:JP600G型超声波提取/乳化机组

  机型结构:超声波发生器与提取罐分体式

  超声频率:28KHz

  超声峰值功率:1000W (由原600W升级至1000W,价格不变)

  提取罐内尺寸:直径320 ×高250mm

  提取罐容积:小于等于20L

  搅拌电机功率:15W

  搅拌电机转速:10-30转/min(可调)

  电加热功率:2KW

  供电电源:220VAC 50HZ 

  具有数显时钟可调功能

  具有数显功率可调功能

  具有数显扫频可调功能

  具有数显温度可调功能


  澳门正规网赌网站专业致力于超声波提取/萃取、超声波乳化、超声波清洗、超声波污水处理、超声波酒类醇化产品的研发、生产及销售。企业拥有多项专利技术。其中“数字式大功率多用途超声波电源系统”获武汉市重大科技成果奖。此项技术中的数字扫频技术为全球首创(专利号为:ZL200320128230.3;获得武汉市重大科技成果证书,证书登记号为:WK200605043。另有专利:ZL200820230265.0,ZL200920087465.X,ZL201020276110.8,ZL201120269926.2),同类厂家尚无此类应用(本企业超声波提取技术是与中科院植物所合作研发起步早起点高,故多被国内其它厂商抄袭,但数字扫频技术其它厂商尚无法复制)。数字扫频实现了用户迫切需要的变频要求的同时还完美的弥补了早期双频或多频技术带来的超声转换效率极低的弊端。此项技术经由全国各大院校的用户使用后反应极佳。应用于植物提取、乳化、污水处理等领域,院校包括:清华大学、北京大学、浙江大学、华中科技大学、武汉大学、华中师大、中国地质大学、武汉科技大学、上海交大、浙江工业大学、兰州大学、河南农业大学、武汉化工学院、吉林大学、四川大学、华南理工大学、华东理工大学、江汉大学、长江大学、中科院武汉植物所、昆明植物所、中科院过程所、中科院武汉物理所、武汉市药检所等。企业产品行销全国除港、澳、台外的所有省份及直辖市。售后方面:企业产品使用自主专利技术故性能稳定、质量极佳。企业承诺5年内免费质保。用户采用超声波需注意的事项:超声波提取方面:一、被提取物需粉碎到20目或更细。粉碎越细得率越高。二、选用合适的提取溶剂。三、根据最终产品的特性和产量合理的安排提取工艺。


  超声波乳化方面:一、乳化液的配方包括乳化剂的用量。二、乳化时间的选定,并不是时间长就越好,乳化过程是分散和聚合不停的循环的过程。按现有试验结果显示10-15分钟的乳化粒径最小可达100纳米。


  最重要的是数字扫频的选择,此项共有16档选择,数值越低则气泡越粗、力量越大;数值越高则气泡越细、力量越小。不同的提取或乳化物质改变数字扫频会带来不同的效果及效率。


  超声波提取天然产物包括超声波提取多肽、氨基酸、核酸、各种酶类、单糖、寡糖、多糖、糖蛋白、树脂、胶体物、木质素、维生素、脂肪、油脂、蜡、生物碱、挥发油、黄酮、糖苷类、苯丙素类、有机酸、酚类、醌类、甾体化合物、抗生素类等。


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